項目介紹：

　　1.原位雜交原理：原位雜交是指將特定標記的已知順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細胞標本或組織標本上進行。

　　2.所需器材：

　　恒溫箱，高壓滅菌鍋，移液槍，鐘擺搖床。

　　3.主要試劑：DEPC。原位雜交固定液。PBS緩沖液。20×SSC洗脫液。蛋白酶K。蘇木素染液。中性樹膠。雜交液。HRP二抗。DAB顯色劑。

　　實驗步驟：

　　石蠟切片DAB顯色原位雜交實驗步驟

　　1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。

　　2、脫水：組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟，包埋。

　　3、切片：石蠟經(jīng)切片機切片，攤片機撈片，62°烤箱烤片2h。

　　4、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

　　5、消化：根據(jù)組織固定時間長短，切片于修復液中煮沸10-15分鐘，自然冷卻。后基因筆畫圈，根據(jù)不同組織不同指標特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。

　　6、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：滴加3%甲醇-H2O2，室溫避光孵育15min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

　　7、預雜交：滴加預雜交液，37°C孵育1h。

　　8、雜交：傾去預雜交液，滴加含探針雜交液, 濃度，恒溫箱度雜交過夜。

　　9、雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。

　　10、滴加封閉液：滴加封閉血清BSA 。室溫30min。

　　11、滴加鼠抗地高辛標記過氧化物酶(anti-DIG-HRP)：傾去封閉液，滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育40min，后PBS洗4次×5min。

　　12、DAB顯色：切片稍甩干后，在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，純水沖洗切片終止顯色。

　　13：復染細胞核：Harris蘇木素復染3min左右，自來水洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水洗，氨水返藍，流水沖洗。

　　14：脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I 6min—100%酒精II 6min-正丁醇6min—二甲苯透明，將切片從二甲苯中拿出稍晾干后，中性樹膠封片。

　　15、顯微鏡檢，圖像采集分析。

　　結(jié)果判讀：陽性為棕黃色，細胞核為藍色。

　　注意事項：mRNA為檢測對象時，需嚴格要求實驗環(huán)境經(jīng)無RNA酶處理。